Nature：顏峻等人發現內源小RNA結合蛋白La，可全面改進先導編輯

撰文丨王聰

編輯丨王多魚

排版丨水成文

2019年10月，劉如謙（David Liu）教授在Nature期刊發表論文【1】，開發了一種精準基因編輯工具——先導編輯（Prime Editor），無需依賴DNA模板和DNA雙鏈斷裂，即可有效實現所有12種單鹼基的自由轉換，還能實現多鹼基的精準插入與刪除。

與CRISPR-Cas9、鹼基編輯等基因編輯工具相比，先導編輯具有精確和高度通用的優點。因此，該工具已被用於遺傳建模、功能基因組學以及遺傳疾病治療等多個領域。此外，還有許多研究嘗試改進先導編輯系統，以提高其編輯效率。然而，關於先導編輯的工作原理以及與細胞環境的相互作用如何影響編輯結果，仍有很多未知之處。

2024年4月3日，普林斯頓大學Britt Adamson團隊（博士生顏峻爲第一作者）在國際頂尖學術期刊Nature上發表了題爲：Improving prime editing with an endogenous small RNA-binding protein 的研究論文【2】。

該研究通過全基因組CRISPRi篩選，發現了先導編輯的一個關鍵細胞決定因子——小RNA結合外切核酸酶保護因子La，將La與先導編輯蛋白融合的先導編輯器PE7，能夠大幅提高先導編輯效率。

第一作者顏峻，本科畢業於清華大學，現爲普林斯頓大學Britt Adamson實驗室博士生

先導編輯（PE）系統由兩部分組成：一個含有DNA切口酶（nickase）和工程逆轉錄酶（RT）的融合蛋白；另一個是PE嚮導RNA——pegRNA。pegRNA包含一個指定目標位點的間隔體（spacer），一個單向導RNA（sgRNA）支架和一個編碼所需編輯的3'端擴展。

該3'端擴展包含一個引物結合位點（PBS），它是互補的一部分DNA原間隔和一個RT模板，編碼所需的編輯和下游基因組序列。PE系統與靶位點結合後，將含有PAM序列的DNA鏈切出，切出的DNA鏈鹼基對與pegRNA中的PBS結合，從而將逆轉錄的編輯序列直接引到靶DNA位點。新合成的編輯DNA的3'端隨後通過細胞DNA修復途徑分解，最終在目標位置進行所需的編輯。

影響先導編輯效率的幾個特徵已經被報道過，包括編輯組件的表達、穩定性、定位和活性，以及目標位點的染色質背景。2021年10月，Britt Adamson團隊與劉如謙團隊合作，在Cell期刊發表論文【3】，證明了當DNA錯配修復（MMR）被抑制或規避時，能夠提高先導編輯效率，這爲促進改進先導編輯系統指明瞭方向。

爲了確定先導編輯的其他細胞決定因素，研究團隊開發了 可擴展的先導編輯報告基因系統，並 進行了全基因組水平的CRISPR干擾（CRISPRi）篩選，成功篩選到了該團隊之前發現的影響先導編輯效率的DNA錯配修復相關基因，以及一個新的 關鍵影響因素——小RNA結合外切核酸酶保護因子La。

La是一種廣泛表達的真核蛋白，參與RNA代謝的多個方面，其最顯著的特徵之一是結合新生RNA聚合酶III（Pol III）轉錄本3'端的多聚尿苷（polyU），並保護它們免受外切核酸酶的破壞。

進一步的研究表明，La能夠促進不同的先導編輯器（PE2、PE3、PE4和PE5）、編輯類型（替換、插入和缺失），以及對不同內源性位點和細胞類型的編輯，但對於Cas9及鹼基編輯器沒有影響。

之前的研究表明，La結合RNA聚合酶III轉錄本的3'末端的多聚尿苷，該研究發現，La與多聚尿苷化pegRNA的3'末端有功能上的相互作用。

基於這些發現，研究團隊開發了一種融合了La的先導編輯蛋白——PE7，基於PE7的先導編輯器還使用了優化La結合的合成pegRNA，以提高先導編輯效率。

接下來，研究團隊評估了PE7在多個疾病治療相關靶點上的編輯效果，包括鐮狀細胞病（HBB）、朊病毒病（PRNP）、家族性高膽固醇血癥（PCSK9）、過繼T細胞轉移療法（IL2RB）、艾滋病（CXCR4）和CDKL5缺乏症（CDKL5）相關靶點。在U2OS細胞系中，與PEmax相比，PE7的編輯效率提升了10倍以上。

總的來說，通過對La作爲先導編輯關鍵細胞決定因子的識別和表徵，該研究擴展了對直接影響先導編輯的細胞過程的理解，展示了提高先導編輯效率的新方法，併爲未來的優化提供了有潛力的新途徑。

論文鏈接：

1. https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4

2. https://www.nature.com/articles/s41586-024-07259-6