國自然撰寫:經典分子機制研究(一)

來源:醫科苑

1. 概念介紹

轉錄水平的調控是真核生物基因表達調控中重要環節。真核細胞 RNA 聚合酶自身對啓動子並無特殊親和力,單獨不能進行轉錄,也就是說基因是無活性的。因此,轉錄需要衆多的轉錄因子和輔助轉錄因子形成複雜的轉錄裝置。在基因轉錄起始階段,通用轉錄因子協助 RNA 聚合酶與啓動子結合,但其作用很弱,不能高效率地啓動轉錄。只有在反式作用因子 (基因特異性轉錄因子)的協助下,RNA 聚合酶Ⅱ和 TFⅡ纔能有效地形成轉錄起始複合物。

反式作用因子(trans acting factor)在轉錄調節中具有特殊的重要性。它是能直接或間接地識別或結合在順式作用元件 8~12bp 核心序列上,參與調控靶基因轉錄效率的一組蛋白質。這類 DNA 結合蛋白有多種,能特異性識別這類蛋白的序列也有多種,正是不同的 DNA 結合蛋白與不同的識別序列之間的空間結構上的相互作用,以及蛋白質與蛋白質之間的相互作用構成了複雜的基因轉錄調控機制的基礎。

在真核生物中轉錄因子的調控是最重要,也是研究得最多的。蛋白質相互作用在轉錄因子活性的調控方面具有重要的意義。細胞內的反式作用因子都是處於有活性和無活性兩種狀態,這兩種狀態是可以轉換的。

反式作用因子處於無活性狀態時,與之相應的基因就不能表達;反式作用因子處於有活性狀態、並與相應的順式作用元件結合時,就可以促進 RNA 聚合酶和通用轉錄因子與相應的啓動子結合,形成轉錄起始複合物。所以,真核基因的表達調控主要是調節反式作用因子的活性,隨後反式作用因子調控基因的轉錄起始。

轉錄因子被激活後,即可識別並結合上游啓動子元件和增強子,對基因轉錄發揮調控作用。大部分轉錄因子在激活以後與順式作用元件結合,但也可能有一些轉錄因子是先結合 DNA,被激活後才發揮調節功能。增強子和上游啓動子元件可以結合一些相同的蛋白質,在不同的基因中,存在着同樣的順式作用元件,這表明一些數量有限的基因調控蛋白控制着真核細胞的基因表達。

每一種轉錄因子結合順式作用元件後雖然可以發揮促進或抑制作用,但是轉錄因子對基因表達的調控不是由單一的因子完成的,而是幾種因子組合,發揮特定的作用。通常是幾種不同的轉錄因子控制一個基因的表達,一種轉錄因子也可以參與調控不同的基因表達調控。轉錄因子的數量是有限的,轉錄因子的組合作用方式使有限的轉錄因子可以調控不同的基因表達。

2. 研究思路

2.1 確定基因 B 啓動子轉錄核心區域

2.1.1 擴增基因 B 上游啓動子區

以基因 B 的轉錄起始位點爲+1,擴增基因 B 啓動子區(-1796bp 到+37bp),電泳結果顯示條帶特異,大小符合預期設計。接着用 DNA 回收試劑盒回收 PCR 所得擴增片段,用內部短引物鑑定 PCR 結果,電泳圖顯示這兩對引物均擴增出位置正確的條帶,_bp 和_bp,提示擴增的 1.8kbp 的片段確實爲基因 B 啓動子。用 DNA 回收試劑盒回收 PCR 產物得基因 B 啓動子(-1796bp 到+37bp)擴增片段。

2.1.2 酶切 PCR 產物和 pGL3-Basic 質粒

因在基因 B 啓動子擴增的引物的兩端插入了 Nhe I 和 Hind III 酶切位點,故用 Nhe I 和 Hind III 限制性酶酶切後與 pGL3-promoter 載體上的 Nhe I 和 Hind III 粘性末端位點相連。

2.1.3 構建 pGL3-Basic-基因 BP(-1761/+37) 質粒 P(promoter)

將酶切的 PCR 產物連入 pGL3-Basic 質粒,經轉化細菌後,挑取單克隆,用基因 B 啓動子內部引物鑑定,挑取鑑定正確的克隆 1、2、3、4、5 送測序。用 Vector NTI 10.0(Invitrogen)軟件對測序結果進行多序列比對。留取測序正確的菌株凍入-80℃ 保存。

2.1.4 不同長度的基因 B 啓動子區的熒光素酶報告基因質粒的構建

用構建好的 pGL3-Basic-基因 BP(-1761/+37)爲模板擴增不同長度的片段,按上述的步驟連入 pGL3-Basic 質粒,測序鑑定正確,-80℃ 保存。

2.1.5 雙熒光素酶報告系統確定基因 B 啓動子區核心區域

我們將成功構建的基因 B 啓動子區的熒光素酶報告基因質粒共同轉染 HEK-293 細胞,並同時轉入 pRL-TK 載體作爲內對照。48 小時後進行熒光素酶報告基因分析。如圖所示:-1761、-1273、-1018、-644、-338、-217 六個不同長度的片段都能夠啓動基因 B 的轉錄,而-217 片段基本喪失轉錄活性,提示基因 B 的轉錄核心區域就位於這段序列中。

運用 TRANSFAC 轉錄因子預測網站我們發現在這 250bp 區域內含有 4 個轉錄因子 A 的結合位點。那麼具體是哪個位點對基因 B 的轉錄起到關鍵的調控作用,然後我們又將這 250bp 的序列截成三部分,檢測其熒光報告強度。結果顯示當將-108 到-42 這段序列截掉後,基因 B 的轉錄活性基本喪失,這說明基因 B 的轉錄核心區域就位於在基因 B 啓動子-108 到-42 內。這段區域決定了基因 B 約 70% 的轉錄活性。上述實驗結果提示,轉錄因子 A 可能通過-108 到-42kb 這 60bp 之間序列激活基因 B 的啓動子區轉錄活性。

註釋:如上是尋找轉錄因子與基因結合位點的套路方案,通過截短不同區域尋找到活性關鍵區域。

2.2 轉錄因子 A 對基因 B 的轉錄調控作用

2.2.1 構建轉錄因子 A 真核表達載體

將編碼轉錄因子 A 的基因序列連入真核表達載體 pcDNA3.1(+) 後經酶切鑑定,出現了_bp 目的條帶,結果與前期設計相符,證明在真核表達載體中插入了相應的轉錄因子 A 蛋白編碼序列,命名爲 pcDNA3.1-轉錄因子 A。

2.2.2 轉錄因子 A 上調基因 B 的轉錄表達

2.2.2.1 體外證實轉錄因子 A 結合基因 B 啓動子

爲了證明轉錄因子 A 可以結合到基因 B 啓動子區的轉錄因子 A 結合位點,我們合成生物素標記的轉錄因子 A 結合位點的寡核苷酸探針,提取 cell-1 細胞的核蛋白,體外進行了 EMSA 實驗。結果顯示,加入核蛋白後可見明顯的遷移條帶,說明生物素探針可以和核蛋白結合,這種結合複合物可以被 100 倍未標記的探針所競爭而明顯減弱。

同時我們也合成了突變轉錄因子 A 結合位點的生物素標記探針,突變探針將不會結合核蛋白,說明遷移條帶確實是轉錄因子 A 和探針所形成的。爲了進一步證實轉錄因子 A 的結合,超遷移實驗顯示加入轉錄因子 A 特異性抗體後,出現明顯的超遷移帶,但是加入無關抗體並不出現此條帶。EMSA 實驗證明轉錄因子 A 可以特異地結合到基因 B 啓動子的轉錄因子 A 結合位點。

2.2.2.2 體內證實轉錄因子 A 結合基因 B 啓動子

染色質免疫共沉澱(ChIP)檢測的是 活細胞狀態下轉錄因子和順式作用元件的結合情況, 近幾年來,該技術被廣泛用於基因轉錄調控的研究。用 ChIP 的方法檢測了基因 B 高表達的 cell-1 細胞和基因 B 低表達的 cell-2 細胞中轉錄因子 A 的結合情況。用轉錄因子 A 抗體沉澱交聯複合體,然後經 RT-PCR 檢測轉錄因子 A 在基因 B 啓動子上的結合序列。

結果顯示,加入轉錄因子 A 抗體後可以特異地沉澱基因組 DNA,通過 PCR 反應可以特異性擴增出基因 B 啓動子上的目的片段,而加入 IgG 的陰性對照未擴增出相應條帶。ChIP 實驗結果在體內證實了轉錄因子 A 與基因 B 啓動子區的結合。同時我們也發現在基因 B 高表達的 cell-1 細胞中轉錄因子 A 結合到基因 B 啓動子的量明顯高於基因 B 低表達的 cell-2 細胞。這也從另一個方面說明轉錄因子 A 結合到基因 B 啓動子區,而且基因 B 的表達量越高其結合轉錄因子 A 的量也越高,轉錄因子 A 對基因 B 的表達調控可能起着上調的作用。

2.2.2.3 突變轉錄因子 A 結合位點顯著下調基因 B 轉錄活性

爲進一步驗證轉錄因子 A 通過結合基因 B 啓動子上-108 到-42 之間的轉錄因子 A 結合位點而激活基因 B 的轉錄表達,我們構建了轉錄因子 A 結合位點突變的基因 B 啓動子熒光報告載體,同時轉入 pRL-TK 載體作爲內對照。轉染 48 小時後進行熒光素酶報告基因分析。結果顯示, 轉錄因子 A 結合位點突變的基因 B 啓動子熒光報告載體的轉錄活性與對照相比顯著下降, 這部分結果提示,轉錄因子 A 通過結合位於基因 B 啓動子上-108 至-42 之間的轉錄因子 A 結合位點,進而激活基因 B 的轉錄表達。

2.3 轉錄因子 A 對基因 B 轉錄激活作用

將野生型的 pGL3-基因 BP(-108/+37)與轉錄因子 A 真核表達載體共轉染,結果顯示隨着轉錄因子 A 質粒用量的增加,基因 B 啓動子區的活性逐漸增強,呈現劑量依賴性。上述結果說明轉錄因子 A 可以結合到基因 B 啓動子區並對其轉錄調控起着上調作用。

2.4 轉錄因子 A 參與基因 B 轉錄調控

爲了進一步說明轉錄因子 A 在基因 B 轉錄調控中的生物學作用,我們運用 RNAi 技術在基因 B 高表達的 cell-1 細胞中下調轉錄因子 A 的表達,然後觀察基因 B 的變化;反之在基因 B 低表達的 cell-2 細胞中通過瞬時轉染轉錄因子 A 真核表達載體過表達轉錄因子 A,然後觀察基因 B 的變化。通過 RT-PCR 和 Western blot 的分析,我們發現轉入 RNA 干擾片段後轉錄因子 A 的 mRNA 和蛋白表達明顯下降,同時基因 B 的 mRNA 和蛋白表達水平明顯被封閉。反之,過表達轉錄因子 A 可以顯著地升高基因 B 的表達水平。上述結果說明轉錄因子 A 參與基因 B 的轉錄調控,並且起着重要的作用。