FSHW | 一種適冷動性球菌來源的絲氨酸蛋白酶的系統功能分析及應用前景

本文系Food Science and Human Wellness原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

Introduction

蛋白酶是一種重要的水解酶，在洗滌劑、食品、紡織、製藥、多肽合成等工業領域佔據着舉足輕重的地位，佔據了世界各地市銷酶總量的近60%的市場份額。冷活性蛋白酶一般來源於嗜冷菌，具有低溫催化效率高、結構靈活等優勢。目前發現，冷活性蛋白酶的應用非常廣泛，包括用於冷洗工業的洗滌添加劑、肉類嫩化和其他食品工業的加工，在這些應用中，該酶表現出極大的節能特性，並具有改善冷藏肉類的口感和風味的特性。

魚類因其豐富的蛋白質、必需氨基酸和多不飽和脂肪酸等對人體健康有益的營養成分而受到消費者的青睞，成爲日常飲食的一部分。近年來，隨着水產養殖和漁業鏈條的不斷髮展，魚類產品的年產量有了顯著的增長，但同時也產生了許多副產品，未得到充分利用或被丟棄。這些副產品可能被用作生產附加值產品的來源，如蛋白質水解物和生物活性肽。

因此，江蘇大學-食品與生物工程學院-水產科學與健康課題團隊高瑞昌教授等在本研究中，旨在研究蛋白酶PmSpr288水解鰱魚肉蛋白的性能，並評價其酶解產物的生物活性功能，以期爲蛋白質水解工業領域提供一種潛在的性能良好的低溫生物催化劑。

圖1 研究設計

Results and Discussion

序列分析及同源建模

利用NCBI ORF查找工具對編碼PmSpr288的基因進行ORF檢測，發現該基因長990 bp，編碼一個多肽，推斷分子量爲35.3 kDa。利用S8家族的肽酶構建的系統發育樹（圖2a）顯示PmSpr288與Planococcus屬處於同一簇。值得注意的是，Planococcus絲氨酸肽酶S8（WP 068488733）與PmSpr288的進化關係最爲密切。保守結構域分析表明，PmSpr288的催化中心由氨基酸殘基Asp49、His86和Ser251組成，Ile129、Leu146和Asn168是其他活性位點。綜上所述，生物信息學分析表明PmSpr288是S8超家族中的一個肽酶。

圖2 系統進化樹與同源建模

PmSpr288在鰱魚蛋白水解中應用

水解研究發現，PmSpr288對肌球蛋白和肌原纖維蛋白具有相當高的蛋白水解活性（圖3）。隨着酶促反應結束，肌球蛋白重鏈（220.0 kDa）、肌動蛋白（44.3 kDa）和肌球蛋白輕鏈（21.0 kDa）等條帶的強度明顯消失。然而，沒有觀察到低分子量蛋白條帶的積累，這意味着高分子量蛋白被高效降解爲富含多肽和氨基酸的水解產物。PmSpr288對魚蛋白的主要成分肌球蛋白和肌原纖維蛋白具有極高的水解能力，爲該酶在魚產品加工工業中的應用提供了進一步的支持，如製備生物活性肽。

圖3 鰱魚肌球蛋白和肌纖維蛋白的水解產物分析

酶與底物的結合機制分析

從圖4a可以看出，對蛋白酶和肌動蛋白結合過程有利的氨基酸被標記（Agr215、Asn224、Asp227、Tyr282、Thr289和Asn301；通過氫鍵連接的Tyr143、Glu167、Lys284、Asp286、Gln354和Lys 373）（黃色）在2.07～3.85 Å之間，鹽橋（粉色）在2.1～3.98 Å之間。同樣，PmSpr288與肌球蛋白的分子對接結果（圖4b）表明，其結合過程主要是通過氫鍵進行的，氫鍵可以增強PmSpr288-肌球蛋白複合物的穩定性，從而促進蛋白酶與蛋白底物的結合和水解。此外，蛋白酶與蛋白質底物之間氫鍵的形成是確定底物中蛋白酶精確切割位點的關鍵步驟，這爲闡明蛋白質從特定的柔性區域開始，然後逐漸降解爲多肽和氨基酸的蛋白質水解過程提供了系統的分析方法。綜上所述，分子對接結果表明，結合區這些關鍵氨基酸殘基形成的氫鍵是促進酶-底物複合物結合的主要力量，有助於PmSpr288對蛋白質的水解過程。

圖4 酶與底物蛋白酶的分子對接

水解條件優化及產物分析

水解條件經響應面優化後，蛋白質水解產物中多肽的分子量分佈見表1。蛋白質水解產物中低分子量（＜1000 Da）肽的含量爲99.44%。其中，180～500 Da佔10.06%，180 Da以下佔89.38%。上述結果表明，PmSpr288能夠水解鰱魚肌肉蛋白併產生多種多肽，爲PmSpr288在生物活性多肽生產中的應用提供了理論依據。

表1 鰱魚肌肉蛋白水解物中多肽的分子量分佈

Conclusion

本研究獲得了一種對魚肉蛋白具有良好水解性能的低溫鹼性蛋白酶（PmSpe288）。該酶與魚肉肌動蛋白和肌球蛋白的結合過程很大程度上是通過氫鍵進行的，這有助於底物蛋白的水解。PmSpr288製備的鰱魚水解液含有大量的低分子量肽，具有良好的抗氧化活性。因此，考慮到生物技術或生物製品中對性能良好的酶的需求日益增長，本文的研究結果將爲其在生產生物活性肽的實際應用，如從魚中生產抗氧化肽、降血壓肽的研究提供理論基礎。

第一作者

冷偉軍，江蘇大學食品與生物工程學院2021屆博士研究生，研究方向爲食品微生物與酶工程，碩博師從高瑞昌教授，目前以第一作者在Food Science and Human Wellness, Journal of the Science of Food and Agriculture, Foods等期刊發表研究型論文SCI 3篇，申請中國發明專利1項。

通信作者

高瑞昌，江蘇大學食品與生物工程學院教授，博導。國家現代農業產業技術體系崗位科學家，江蘇省“333”、“六大人才高峰”高層次人才，江蘇大學食品生物工程與智能裝備方向帶頭人，中國生物工程學會理事，中國食品科技學會青年工作委員會委員。長期從事食品蛋白質加工與綜合利用、水產食品組分與營養功效和食品風味化學等領域研究，主持與參與國家自然科學基金等項目20多項。Trends in Food Science & Technology、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Journal of Agricultural and Food Chemistry，Food Chemistry，Food & Function發表SCI論文100多篇。授權國家發明專利17件，申請國家發明專利38件，授權美國、日本專利各1件；獲江蘇省科技進步獎等省部級和市廳級獎勵5項。《Food Biotechnology International》編委、《未來食品科學》編委、《食品科學》編委和《肉類研究》編委。

Systematic functional analysis and potential application of a serine protease from cold-adapted Planococcus bacterium

Weijun Lenga, Xiaoyun Wua, Xianghui Qia, Hongying Liub, Li Yuana,*, Ruichang Gaoa,*

a School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

b Ocean College of Hebei Agriculture University, Qinhuangdao 066000, China

*Corresponding authors.

Abstract

In this study, a gene encoding serine protease (PmSpr288) from cold-adapted bacterium, namely Planococcus maritimus XJ11, was cloned and overexpressed in Escherichia coli BL21 (DE3). Bioinformatics analysis revealed that PmSpr288 belongs to serine protease S8 superfamily with a classical catalytic triad comprised by the Asp49, His86 and Ser251. Moreover, PmSpr288 was found to be active over broad alkaline pH and low-moderate temperature, and exhibited wide range of protein substrate specificity. In addition, PmSpr288 was able to hydrolyze the meat proteins actin and myosin, and molecular docking results suggested that the crucial interaction between PmSpr288 and actin/myosin complexes was mainly occupied by hydrogen bonds. The muscle protein hydrolysates of silver carp prepared by PmSpr288 was shown to have antioxidant activity via DPPH radical scavenging assay, which presented an IC50 valve of 1.309 mg/mL. In conclusion, these characteristics imply that PmSpr288 has potential biotechnological application prospect for the production of bioactive peptides.

Reference:

LENG W J, WU X Y, QI X H, et al. Systematic functional analysis and potential application of a serine protease from cold-adapted Planococcus bacterium[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1751-1761. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.025.

文章編譯內容由作者提供

編輯：樑安琪；責任編輯：張睿梅

封面圖片來源：圖蟲創意

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