慘了，因質粒用錯，博士被撤稿，痛失學位，導師：我不允許各位重蹈覆轍.....
質粒，小小的身體，大大的能量，對奮戰在生物實驗室的科研人而言是熟悉的夥伴。科學的車輪緩緩駛過，生化實驗室不能失去質粒，正如西方不能失去耶路撒冷。
面對質粒，不少科研人心中五味雜陳，幾家歡喜幾家愁，質粒構建表達成功皆大歡喜，構建失敗輕則耽誤時間，重則影響畢業大計。
而有人則因構建質粒水平過於高超，讀博多年歸來，依然是替全課題組構建質粒的「工具人」，導師抓住一隻羊使勁地薅羊毛，誓要讓其發光發熱到最後一分鐘。
來源：小紅書
質粒構建難題頻出，猶如玄學
學霸君看完之後，既同情該網友的困境，又暗暗佩服其構建質粒百發百中的能力。畢竟，質粒構建與表達是分子生物學的技術難題，被質粒折磨得苦不堪言的人不在少數。
有人半夜輾轉難眠，爲質粒實驗苦心孤詣，好不容易克服了酶切濃度不夠、轉化失敗的困難，又面臨 PCR 之後的條帶暗淡無光的挑戰。
每一步都嚴格按照師兄給的步驟嚴格執行，實驗結果卻顆粒無收。
來源：網絡
每一個不長菌的培養皿，每一支廢棄的離心管，見證了科研人在努力構建質粒時的茫然無措與心塞。
來源：圖蟲創意
來源：圖蟲創意
有人慾哭無淚，給別人構建重組質粒時百發百中，給自己構建質粒時，換了三個載體始終得不到想要的結果。幸運是有的，但不多，全部轉移給他人了。
來源：網絡
有人花費半年的時間構建一個簡簡單單的質粒，卻始終敲不開成功的大門，就在最後一次打算放棄時，隨便挑了三個菌落測序，意外地一次性成功。
踏破鐵鞋無覓處，得來全不費工夫，不得不說這是一門玄學。
來源：網絡
質粒構建和表達有絕招，細節必不可少
細節決定成敗，質粒構建、轉化、提取、鑑定、轉染、測定一條龍過程結束，嚴格貫徹「細節爲先」尤爲重要，方能提高實驗成功率。
首先，要熟悉目的質粒的構造和細節，做到有的放矢。世界上有無數種質粒, 天然存在的、人爲改造的 …… 形態和功能數不勝數，讓人眼花繚亂。
但質粒就像好比人，再複雜的「人」都由「鼻子+眼睛+嘴巴+耳朵」構成，換而言之，再複雜的質粒都由「起始位點+啓動子+酶切位點+外源片段」等基本元件構成。
學霸君在此推薦以下方法讓你先人一步掌握質粒細節：
1. 使用 Vector NTI 軟件，裡面含有大量常見和經典的質粒圖譜，能夠對質粒圖譜瞭解更直觀。
2. 查找質粒圖譜的網站，能夠對質粒的來源、構造和功能充分掌握。
Addgene 網址：http://www.addgene.org/
來源：Addgene
Vector DB 網址：http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.html
NCBI 網址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
歐洲分子生物學實驗 EMBL：http://www.ebi.ac.uk/
其次，需要提醒的是，很多人的實驗止步於提純 DNA 這一步，使得前期工作付諸流水。通常，按得到質粒 DNA 的量可將質粒抽提方法和試劑盒分爲小提，中提，大提。
做實驗嚴絲合縫地按照步驟執行是嚴謹的體現，但是有時候也要在不違背主體原則下靈活地改變，例如，在提取質粒時，根據菌液量、實驗目的等需要，靈活地選擇合適的提取方案，才能獲得濃度達標的 DNA，有效快速地推進實驗。
畢竟，DNA 濃度直接關係到酶切、酶連、轉化等一系列關鍵步驟，科研小夥伴不得不提起十二分精神。
來源：MCE 官網
此外，學霸君曾受轉化步驟困擾，塗菌後的培養皿比臉還乾淨。經驗豐富之後，才知道其中玄機滿滿。
失敗原因：轉化後塗菌太少。
改進措施：將搖好的菌離心棄上清, 取沉澱的一半塗板，尤其是構建質粒時, 也可沉澱全部塗板。
失敗原因：轉化後搖菌時間過短。
改進措施：適當增加搖菌時間，12-14 小時爲佳。
失敗原因：感受態失效或錯誤使用。
改進措施：切勿反覆凍融，切勿劇烈振盪。
失敗原因：抗生素加的比例過多或過少, 長出雜菌。
改進措施：細心認真地確認抗生素的添加是否正確，設置對照組。
東風借力，獲得令人安心的質粒
質粒構建看似簡單，實則每一步暗含玄機，稍有不慎，連累整個實驗進程。之前有研究顯示，近 50% 的實驗室質粒存在明顯的設計缺陷及序列錯誤。
東京醫科牙科大學某博士因錯誤的質粒被撤銷了博士學位，還有人因質粒使用不當被撤稿。這都是血淚教訓！
來源：東京醫科牙科大學官網，撤銷博士學位聲明
俗話說，他山之石，可以攻玉。除了自己努力構建質粒之外，學霸君在這裡爲大家推薦一個巧妙實用、事半功倍的方法，爲方便迅捷地獲得目的質粒保駕護航。
Addgene 是一個全球性的、非營利性的生物資源儲存庫，幫助科學家分享質粒的優質平臺。它收藏了來自世界各地的 6109 個實驗室的 146411 個質粒，其中包含 895 種即用型病毒載體和 214 種重組抗體。
重要的是，這些質粒被來自 111 個國家的科學家們充分利用，已經被請求使用 2128046 次。
來源：Addgene 官網
此外，該平臺還提供質粒寄存服務，當科學家發表研究論文時，他們可以將相關的質粒寄存在 Addgene，由 Addgene 提供質量控制、購買資質審覈，簽署合規性文件、產品運輸和記錄保存等服務，免去了科研人互相聯繫和郵寄質粒的滯後性，將其從繁瑣的事務中解放出來。
這些被記錄到科學論文裡的質粒們遠渡重洋，走遍世界，爲人類科研事業的進步增磚添瓦。
例如，在平臺上能看到基因編輯先驅之一張鋒院士實驗室的經典質粒，後面還貼上了文獻來源 — 在 Science 雜誌發表的研究論文 Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells，令人一目瞭然，工作效率翻倍。
當然，這些質粒的使用僅限學術機構和非營利組織哦，小夥伴們在使用院士同款質粒時，也要愛惜個人學術羽毛，不能隨意用其從事商業活動。
來源：Addgene 官網
來源：Addgene 官網
質粒構建非一朝一夕的功夫，還得仔細揣摩，願小夥伴們構建一個成功一個。大家還有什麼經驗要分享嗎？歡迎在留言區討論。
題圖來源：圖蟲創意
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